Peraturan Badan ini mulai berlaku pada tanggal diundangkan. Agar setiap orang mengetahuinya, memerintahkan pengundangan Peraturan Badan ini dengan penempatannya dalam Berita Negara Republik Indonesia. Ditetapkan di Jakarta pada tanggal 10 Januari 2023 KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN, ttd. PENNY K. LUKITO Diundangkan di Jakarta pada tanggal 10 Januari 2023 MENTERI HUKUM DAN HAK ASASI MANUSIA ttd. YASONNA H. LAOLY BERITA NEGARA REPUBLIK INDONESIA TAHUN 2023 NOMOR 50 LAMPIRAN PERATURAN BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN NOMOR 2 TAHUN 2023 TENTANG PEDOMAN PENGKAJIAN KEAMANAN DAN/ATAU MUTU OBAT DAN BAHAN OBAT TERHADAP CEMARAN NITROSAMIN PEDOMAN PENGKAJIAN KEAMANAN DAN/ATAU MUTU OBAT DAN BAHAN OBAT TERHADAP CEMARAN NITROSAMIN Pada tahun 2018, N-nitrosodimetilamin (NDMA) dan N-nitrosodietilamin (NDEA) terdeteksi sebagai cemaran pada beberapa Bahan Obat golongan Angiotensin Receptor Blocker (ARB) seperti valsartan dan Bahan Obat yang menggunakan rute sintesis tertentu. Pengamatan tersebut memicu penilaian rute sintesis lebih lanjut dan pengembangan metode analisis untuk mengukur kedua Cemaran Nitrosamin ini. Sebagai konsekuensi, terdapat tambahan kriteria Obat yang dievaluasi. Selain NDMA dan NDEA, dalam beberapa kasus turunan Nitrosamin lainnya juga harus menjadi perhatian. Dalam upaya membatasi potensi kelompok senyawa Nitrosamin yang diduga mempunyai efek karsinogenik, maka pedoman ini disusun sebagai panduan dalam pengendalian risiko Cemaran Nitrosamin pada Obat dan Bahan Obat. Rekomendasi yang diberikan mencakup penetapan:
a.sistem pengendalian kadar Nitrosamin untuk memastikan nilai cemarannya di bawah batas asupan interim yang dapat diterima; dan
b.tindak lanjut yang harus dilakukan Industri Farmasi terkait hasil kajian risiko keberadaan Cemaran Nitrosamin. Terdapat beberapa mekanisme yang menyebabkan masuk atau terbentuknya Nitrosamin sebagai cemaran dalam produk farmasi. Secara khusus, Nitrosamin terbentuk melalui reaksi kimia amina sekunder atau tersier dengan nitrit dalam kondisi asam. Beberapa contoh sumber atau rute sintesis yang dilaporkan dapat mengarah pada pembentukan Nitrosamin berdasarkan identifikasi empiris atau dilaporkan dalam literatur diantaranya sebagai berikut (tetapi tidak terbatas pada):
1.Proses pengolahan Bahan Obat dalam kondisi tertentu dan adanya reagen, pelarut, bahan baku, dan alat bantu pengolahan tertentu. Walaupun terdapat langkah-langkah pengolahan dan pemurnian, spesi reaktif baik yang sengaja ditambahkan atau terbentuk selama proses/reaksi (misalnya, nitrit dan amina sekunder dalam kondisi asam) dapat terbawa ke langkah berikutnya (lihat Gambar 1. Reaksi Pembentukan Nitrosamin). Pembentukan senyawa heterosiklik yang mengandung nitrogen dengan menggunakan azida diikuti dengan penambahan asam nitrat untuk menghilangkan kelebihan azida perlu diberikan perhatian khusus. Gambar 1. Reaksi Pembentukan Nitrosamin
2.Bahan Obat yang dapat terdegradasi dalam beberapa kondisi yang mengakibatkan pembentukan Nitrosamin (misalnya, ranitidin).
3.Degradasi pelarut (misalnya, dimetilformamida (DMF)) yang mengarah pada pembentukan dialkil amina).
4.Pengotor dalam bahan baku, pelarut (termasuk pelarut daur ulang), reagen, atau katalis.
5.Pengotor dalam bahan dan bahan antara, reagen, dan pelarut yang digunakan untuk menyiapkan bahan awal atau bahan antara.
6.Pengotor dalam air, eksipien, atau alat bantu pengolahan yang digunakan dalam produksi Obat.
7.Selama pembuatan Obat dalam kondisi reaksi tertentu dan dengan adanya prekursor untuk pembentukan Nitrosamin.
8.Pengotor dalam sistem penutup wadah untuk Obat, yang mungkin mampu membentuk Nitrosamin, terutama jika terkait dengan bahan yang mengandung amina dan sumber potensial zat penitrosasi (misalnya, nitrit, nitroselulosa). Sejauh ini telah diidentifikasi dan dilaporkan tujuh Cemaran Nitrosamin yang secara teoritis bisa terdapat dalam Obat, yaitu N-nitrosodimetilamin (NDMA), N-nitrosodietilamin (NDEA), Asam-N-nitroso-N-metil-4- aminobutirat (NMBA), N-nitrosoisopropiletilamin (NIPEA), N- nitrosodiisopropilamin (NDIPA), N-nitrosodibutilamin (NDBA), dan N- nitrosometilphenilamin (NMPA). Lima di antaranya (NDMA, NDEA, NMBA, NIPEA, dan NMPA) telah terdeteksi dalam Obat dan Bahan Obat. B. Tujuan Pedoman ini bertujuan untuk memberikan informasi terkait Cemaran Nitrosamin, memberikan rekomendasi langkah yang harus dilakukan oleh produsen bahan aktif Obat dan industri Obat untuk mendeteksi keberadaan dan mencegah pembentukan Cemaran Nitrosamin pada kadar yang tidak dapat diterima dalam Obat dan Bahan Obat. Pedoman ini juga sebagai acuan bagi Industri Farmasi dalam melaksanakan analisis risiko Obat yang berpotensi mengandung Cemaran Nitrosamin agar dapat mendeteksi dan mencegah keberadaan cemaran tersebut guna menjamin keamanan dan mutu Obat yang beredar di Indonesia. C. Ruang Lingkup Ruang lingkup pedoman ini mencakup semua Obat dan/atau Bahan Obat yang beredar di Indonesia, baik yang mengandung bahan aktif farmasi yang disintesis secara kimia, maupun produk Obat biologi. Karakterisasi risiko senyawa Nitrosamin dengan pendekatan TTC tidak dapat diterapkan dan sebagai alternatif, harus tersedia data keamanan untuk menentukan Acceptable Intake (AI). Terdapat sejumlah metode yang digunakan oleh para toksikologis dalam penentuan nilai AI antara lain dengan menggunakan pendekatan Tumorigenic Dose Rate 50 (TD50), Bench Mark Dose Lower 95% Bound Confidence Limit (BMDL10) sebagai basis perhitungan. Dalam hal ini, digunakan TD50 dari NDMA, NDEA, dan senyawa Nitrosamin lainnya sebagai data representatif dalam melakukan ekstrapolasi linier untuk menentukan tingkat risiko yang dapat diterima. Pendekatan TD50 sebagai Point of Departure (PoD) telah disepakati dan terharmonisasi secara Internasional berdasarkan pedoman ICH M7 (R1). Berdasarkan informasi tersebut, batas asupan interim yang dapat diterima untuk cemaran spesifik yang telah diadopsi oleh sebagian besar regulator internasional terdapat pada Tabel 1. Karena kemiripan secara struktur, NDIPA, NIPEA, NMPA, dan NMBA dianggap memiliki profil toksikologi seperti NDMA dan NDEA oleh regulator internasional. Sedangkan, untuk Cemaran Nitrosamin yang tidak terdapat dalam Tabel 1, prinsip dalam pedoman ICH M7 (R1) dapat digunakan dalam menentukan AI. Tabel 1. Batas asupan harian interim yang dapat diterima untuk cemaran N-Nitrosamin Nama Singkatan Nama Cemaran Asupan yang dapat diterima (AI limit) (ng/hari) NDMA N-nitrosodimetilamin 96,0 NDEA N-nitrosodietilamin 26,5 NMBA Asam-N-nitroso-N-metil-4- aminobutirat 96,0 NMPA N-nitrosometilphenilamin 26,5 NDIPA N-nitrosodiisopropilamin 26,5 NIPEA N-nitrosoisopropiletilamin 26,5 Dalam hal ini, AI merupakan paparan harian terhadap senyawa NDMA, NDEA, NMBA, NDIPA, atau NIPEA yang memiliki risiko kanker 1:100.000 dengan durasi pemaparan selama 70 tahun. Konversi batas asupan yang dapat diterima ke dalam satuan bagian per juta (bpj) dalam produk, dapat bervariasi antar produk dan dihitung berdasarkan dosis harian maksimum/maximum daily dose (MDD) yang disetujui. Kadar Nitrosamin yang dapat diterima = 𝐴𝐼 𝑀𝐷𝐷 AI = asupan Nitrosamin yang dapat diterima (μg/hari) MDD = dosis harian maksimum Bahan Obat (g/hari) Industri Farmasi direkomendasikan untuk menggunakan AI pada Tabel 1 Batas asupan harian interim yang masih diizinkan untuk cemaran N- Nitrosamin ketika menentukan batas Cemaran Nitrosamin dalam Bahan Obat dan Obat. Batas pada Tabel 1 berlaku jika dalam produk Obat hanya mengandung Cemaran Nitrosamin tunggal. Jika terdeteksi lebih dari satu Cemaran Nitrosamin dalam Tabel 1 dan kuantitas total Cemaran Nitrosamin lebih besar dari 26,5 ng/hari (yaitu acceptable intake Cemaran Nitrosamin yang paling poten) berdasarkan nilai MDD, Industri Farmasi harus berkonsultasi dengan Badan POM untuk melakukan evaluasi. Misalnya, untuk produk Obat dengan MDD 880 mg/hari, maka batas kadar total Nitrosamin 0,03 bpj tidak akan melampaui batas AI 26,5 ng/hari. Pengujian Nitrosamin memerlukan prosedur analisis yang sensitif untuk dapat mendeteksi dan menetapkan kadar Cemaran Nitrosamin yang rendah. Umumnya, prosedur yang paling reliable serta memiliki sensitivitas dan selektivitas yang baik adalah teknik pemisahan kromatografi yang dilengkapi dengan detektor spektrometri massa, contoh: Kromatografi Cair Kinerja Tinggi-Spektrofotometri Massa/ Spektrofotometri Massa (KCKT-SM/SM) dan Kromatografi Gas-Spektrofotometri Massa/Spektrofotometri Massa (KG- SM/SM). Contoh metode analisis kuantitatif hasil pengembangan metode di Pusat Pengembangan Pengujian Obat dan Makanan Nasional (PPPOMN) tercantum sebagaimana dalam BAB V. Jika digunakan metode analisis alternatif, perlu dilakukan validasi metode analisis dengan mengacu pada Lampiran FI Edisi VI, Validasi Prosedur dalam Farmakope <1381> atau sesuai perkembangan kompendial terkini lainnya dan pedoman yang berlaku secara internasional. Terdapat beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pengujian Cemaran Nitrosamin. Preparasi sampel yang tepat merupakan langkah penting dalam menganalisis Cemaran Nitrosamin dengan kadar rendah. Untuk mencegah kehilangan atau pembentukan Nitrosamin sebagai artefak prosedur analisis, perlu diperhatikan hal-hal berikut:
a.terbentuknya artefak Nitrosamin secara in situ, khususnya pada analisis menggunakan metode KG. Contoh: adanya dialkil amin (dimetilamin) sebagai cemaran proses atau counter ion garam bahan aktif yang dengan adanya nitrit dan asam; dan pada pengujian Nitrosamin dalam ranitidin dengan kondisi suhu tinggi.
b.pelarutan total versus ekstraksi selektif: jika senyawa Obat mengandung gugus dimetilamino, perlu dihindari pelarutan senyawa Obat bila digunakan teknik analisis KG. Senyawa Obat dengan gugus dimetilamino pada konsentrasi tinggi dengan adanya pereaksi nitrosasi dapat menghasilkan Nitrosamin di dalam port injeksi ketika disuntikkan ke dalam instrumen KG. Pada kondisi ini, ekstraksi sampel harus dilakukan untuk mencegah pelarutan senyawa Obat (dalam hal ini berperan sebagai matriks) dengan tetap mempertahankan efisiensi ekstraksi Nitrosamin yang terkandung pada sampel uji. Beberapa hal juga diketahui dapat mengganggu penetapan Nitrosamin:
a.adanya sesepora (trace amounts) Nitrosamin dalam bahan dan alat yang digunakan dalam pengujian (misalnya air, udara, wadah plastik, tutup karet/elastomer).
b.Adanya puncak spesifik Nitrosamin tertentu yang berhimpitan dengan puncak senyawa lain misalnya co-eluting DMF dengan NDMA. Evaluasi karakteristik kinerja analitik Nitrosamin dapat dilakukan dengan dengan mengacu pada Lampiran FI VI, Validasi Prosedur dalam Farmakope <1381>. Kriteria kinerja untuk parameter ini harus ditetapkan dengan tepat dan dikonfirmasi melalui validasi untuk memastikan bahwa metode tersebut sesuai untuk tujuan penggunaan berdasarkan analit spesifik, matriks, dan kebutuhan presisi serta akurasi prosedur analisis. Presisi dan recovery sangat bergantung pada konsentrasi dan kompleksitas matriks, dan justifikasi kriteria keberterimaan yang diusulkan perlu dinyatakan dalam dokumentasi prosedur validasi. B. Contoh Perhitungan Batas Cemaran dalam Sediaan Berdasarkan Dosis Harian Maksimum Berikut merupakan perhitungan batas maksimum cemaran NDMA dalam tablet Valsartan (dengan asumsi berat badan populasi adalah 50 kg dan dosis maksimum harian Valsartan adalah 320 mg/hari) menggunakan basis perhitungan TD50. - Nilai TD50 untuk NDMA adalah 0,096 mg/kg berat badan/hari (Pustaka: EMA. Nitrosamine impurities in human medicinal products, 2020). - Perhitungan: Dilakukan ekstrapolasi untuk menghitung the excess risk level for cancer pada level 1:100.000 dengan cara membagi nilai TD50 dengan 50.000 sehingga: (0,096 mg/kg berat badan/hari) / 50.000 = 0,00000192 mg/kg berat badan/hari atau 1,92 ng/kg berat badan/hari. Untuk orang dengan berat badan 50 kg, maka akan menghasilkan nilai AI = 50 kg x 1,92 ng/kg berat badan/hari = 96 ng/hari yang setara dengan (96/1000) μg/hari / 0,32 g = 0,3 ppm NDMA dalam tablet Valsartan dengan dosis maksimum harian adalah 0,32 gram. Gambar 2. Alur Kajian Risiko Keberadaan Nitrosamin Berdasarkan gambar skenario di atas, dapat dijelaskan langkah yang harus dilakukan oleh Industri Farmasi adalah sebagai berikut:
1.Industri Farmasi melakukan penilaian risiko keberadaan Cemaran Nitrosamin (Bahan Obat dan Obat). Industri dapat mengikuti form yang tertera pada Formulir 1A, 1B, 1C, dan 1D pada pedoman ini atau dapat mengacu pada pedoman “ICH guidance for industry Q9 Quality Risk Management”. Berdasarkan hasil yang diperoleh dari kajian tahap 1, rekomendasi tindak lanjut adalah sebagai berikut:
a.Apabila hasil kajian keberadaan Cemaran Nitrosamin menunjukkan tidak adanya potensi keberadaan Cemaran Nitrosamin, industri tidak perlu melaporkan hasil kajian kepada BPOM. Hasil kajian tersebut merupakan dokumen mutu industri yang apabila dibutuhkan dalam rangka pengawasan pre dan post market, BPOM dapat meminta dokumen tersebut.
b.Apabila hasil kajian keberadaan Cemaran Nitrosamin menunjukkan adanya potensi keberadaan Cemaran Nitrosamin, industri melanjutkan ke tahap 2.
2.Industri Farmasi melakukan uji konfirmasi melalui pengujian menggunakan metode analisis kuantitatif hasil pengembangan laboratorium BPOM sebagaimana tercantum dalam BAB V atau metode lain yang sudah divalidasi. Risiko keberadaan Nitrosamin? Tahap 1 Industri melakukan penilaian risiko keberadaan Cemaran Nitrosamin (Bahan Obat dan Obat) Industri tetap mendokumentasikan hasil penilaian risiko namun tidak perlu melaporkan hasil penilaian risiko kepada BPOM Tidak Ya Tahap 2 Industri melakukan uji konfirmasi Skenario A kadar Nitrosamin > nilai AI Skenario B 10% AI < kadar Nitrosamin < AI Skenario C Nitrosamin tidak terdeteksi atau kadar Nitrosamin ≤ 10% AI Tahap 3 Industri melaporkan hasil kajian risiko kepada BPOM Skenario Jumlah bets Bahan Obat dan/atau Obat yang diuji harus representatif dan mempertimbangkan risiko. Jika sumber risiko telah diidentifikasi dengan baik sehingga tingkat cemaran diharapkan konsisten dari bets ke bets, pengujian dilakukan pada 10% jumlah bets setahun, atau 3 bets per tahun, dipilih yang tertinggi. Jika produksi kurang dari 3 bets dalam setahun, maka semua bets diuji. Pengujian tidak hanya pada bets yang baru diproduksi tetapi juga sampel bets yang disimpan dan belum mencapai kedaluwarsa. Untuk Bahan Obat dapat menggunakan data dari produsen yang dilengkapi dengan data dukung hasil pengujian yang memadai. Dari hasil uji konfirmasi yang dilakukan, langkah selanjutnya mengikuti skenario berikut:
a.Skenario A • hasil uji konfirmasi ditemukan Cemaran Nitrosamin dengan kadar melebihi nilai AI, atau • hasil uji konfirmasi ditemukan total kadar Nitrosamin melebihi nilai AI Nitrosamin yang paling poten (jika ditemukan Cemaran Nitrosamin lebih dari satu).
b.Skenario B • hasil uji konfirmasi ditemukan Cemaran Nitrosamin dengan kadar lebih besar dari 10% nilai AI dan lebih kecil dari nilai AI, atau • hasil uji konfirmasi ditemukan total kadar Nitrosamin lebih besar dari 10% nilai AI dan lebih kecil dari nilai AI Nitrosamin yang paling poten (jika ditemukan Cemaran Nitrosamin lebih dari satu).
c.Skenario C • hasil uji konfirmasi ditemukan tidak terdeteksi Cemaran Nitrosamin, atau • hasil uji konfirmasi ditemukan total kadar Nitrosamin kurang dari atau sama dengan 10% nilai AI Nitrosamin yang paling poten (jika ditemukan Cemaran Nitrosamin lebih dari satu).
3.Industri Farmasi harus melaporkan kepada Badan POM c.q Ditwas KMEI ONPPZA (dalam rangka pengawasan post market) sesegera mungkin, selambat-lambatnya 40 (empat puluh) Hari terhitung sejak hasil kajian risiko pada Tahap 1 menunjukkan potensi keberadaan Cemaran Nitrosamin pada Obat dan/atau Bahan Obat. Apabila dalam waktu yang sudah ditentukan, Industri Farmasi belum dapat menyerahkan laporan, perlu disampaikan progress pelaksanaan kajian risiko disertai justifikasi kepada BPOM. Badan POM akan melakukan evaluasi dalam waktu 40 Hari untuk menetapkan tindakan pengaturan lebih lanjut sebagai berikut:
a.Skenario A: berdasarkan laporan dari Industri Farmasi, Badan POM akan membentuk tim untuk menentukan tindakan regulatori yang sesuai.
b.Skenario B: perlu dilakukan registrasi variasi untuk menetapkan batas Cemaran Nitrosamin pada spesifikasi Obat. Industri Farmasi harus membuktikan kadar Cemaran Nitrosamin konsisten berada dibawah 30% AI. Berdasarkan evaluasi, Badan POM dapat menentukan kemungkinan apakah diperkenankan untuk tidak dilakukan pengujian rutin.
c.Skenario C: pelaporan Industri Farmasi sebagai notifikasi kepada Badan POM dan tidak diperlukan aksi lebih lanjut. Laporan yang disampaikan ke Badan POM dilengkapi dengan analisa akar penyebab masalah, langkah-langkah tindak lanjut yang dilakukan dan akan dilakukan berdasarkan hasil kajian sesuai jenis skenario termasuk langkah tindak lanjut terhadap produk yang telah didistribusikan dan beredar di masyarakat. Apabila keberadaan Cemaran Nitrosamin berdampak pada perubahan proses pembuatan Obat seperti namun tidak terbatas pada perubahan zat aktif, proses produksi Obat, maka Industri Farmasi harus melakukan registrasi variasi sesuai dengan jenis variasi yang relevan. Baku Pembanding Baku Pembanding N-Nitrosodimethylamine (NDMA) 200 ppm Baku Pembanding N-Nitrosodiethylamine (NDEA) Peralatan Seperangkat alat Kromatograf Gas dengan kolom G25, G35 berdimensi panjang 30 m, diameter dalam 0,25 mm, ketebalan film 0,25 μm dilengkapi detektor MS/MS. * Pada penelitian ini digunakan kolom TG-WAXMS (Thermo Scientific), dapat digunakan tipe kolom lain yang setara. Prosedur
a.Pelarut Metanol derajat MS.
b.Larutan Baku Persediaan NDEA 1000 ppm (Larutan A) Pipet saksama 10 μL Baku Pembanding NDEA, masukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda.
c.Larutan Baku Persediaan NDEA 1 ppm (Larutan B) Pipet saksama 10 μL Larutan Baku Persediaan NDEA 1000 ppm, masukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, diencerkan dengan Pelarut sampai tanda.
d.Larutan Baku Campuran NDEA dan NDMA 1 ppm (Larutan C) Pipet masing-masing 100 μL Baku Pembanding NDMA 1 ppm dan 20 μL Larutan Baku Persediaan NDEA 1000 ppm, masukkan ke dalam labu tentukur 20 mL, encerkan dengan air sampai tanda.
e.Larutan Uji Timbang tidak kurang dari 20 tablet dan tentukan bobot rata-ratanya, serbukkan hingga homogen. Timbang sejumlah serbuk setara dengan seperempat bobot rata-rata tablet, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL. Tambahkan 3 mL Pelarut, kocok larutan menggunakan alat vortex selama lebih kurang satu menit dan encerkan dengan pelarut sampai tanda. Sentrifugasi larutan selama 10 menit dengan kecepatan 1500 RPM dan saring menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,45 μm.
f.Larutan Baku Kerja Dibuat seri larutan baku kerja dengan metode standar adisi dari Larutan C, diencerkan dengan Pelarut hingga diperoleh konsentrasi seperti yang tertera dalam tabel berikut:
g.Cara Penetapan Suntikkan masing-masing Pelarut, Larutan Baku Kerja dan Larutan Uji ke dalam Kromatograf Gas Spektrometri Massa dengan kondisi sebagai berikut: Kolom : Kolom G25, G35 dengan panjang 30 m, diameter dalam 0,25 mm dengan ketebalan film 0,25 μm. Gas Pembawa : Helium Split Rasio : splitless Volume penyuntikan : 1 μL Suhu Injektor : 250 °C Suhu Interface : 250 °C Suhu Detektor (Quad 1) : 150 °C Suhu Detektor (Quad 2) : 150 °C Temperature Program Suhu kolom 40oC ditahan selama 0,5 menit, dinaikkan 20oC/menit hingga suhu 200oC, dinaikkan 60oC/menit hingga 240oC dipertahankan selama 3 menit. Detektor : MS/MS Tipe reaksi : MRM NDMA MRM start time : 4,00 menit NDEA MRM start time : 7,80 menit MRM Parameters: Analit Precursor ion Cone (eV) Product ion Collision energy (eV) Ionization mode NDMA 74,1 -30 42 44,1 (Q) 15 5 EI NDEA 102,1 -30 56,1 85,1(Q) 15 5 EI *ion kuantitasi Baku Kerja Volume pemipetan Larutan C (μL) Volume Baku Kerja (mL) Konsentrasi NDEA dan NDMA (ppb) 1 3 1 3 2 5 1 5 3 10 1 10 4 25 1 25 5 50 1 50 6 80 1 80 7 100 1 100 8 200 1 200 Ionisasi : EI Nitrogen Collition Gas: 1,5 mL/menit Solvent Delay : 4 menit Source temp : 250°C
h.Interpretasi Hasil 1) Jumlah NDMA (ng/mg) dalam tablet Sartan dihitung menggunakan rumus (ppm): K = [(y-a) / b] x Fu÷ wt Keterangan: y = Luas puncak NDMA Larutan Uji a = Nilai intersep yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku b = Nilai slope yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku Fu = Faktor pengenceran Larutan Uji Wt = Bobot uji serbuk dari tablet dalam mg 2) Jumlah NDEA (ng/mg) dalam tablet Sartan dihitung menggunakan rumus (ppm): K = [(y-a) / b] x Fu÷ wt Keterangan: y = Luas puncak NDEA Larutan Uji a = Nilai intersep yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku b = Nilai slope yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku Fu = Faktor pengenceran Larutan Uji Wt = Bobot uji serbuk dari tablet dalam mg B. Penetapan Kadar Cemaran N-Nitrosodimetilamin (NDMA) dalam Bahan Baku Metformin Hidroklorida Secara Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi- Spektrometri Massa (LC-MS/MS) Ruang Lingkup Metode ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran N- Nitrosodimetilamin (NDMA) dalam bahan baku Metformin hidroklorida secara Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi-Spektrometri Massa (LC- MS/MS). Baku Pembanding N-Nitrosodimethylamine (NDMA) konsentrasi 200 μg/mL. Peralatan Seperangkat alat Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi dengan kolom C18, HSS-T3 panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm, dan ukuran partikel 1,8 μm dilengkapi detektor MS/MS. * Pada penelitian ini digunakan kolom HSS-T3 (Waters), dapat digunakan tipe kolom lain yang setara. Prosedur
a.Pelarut Air bebas mineral.
b.Larutan Baku Persediaan NDMA (500 ppb) Pipet 1 mL larutan baku NDMA (konsentrasi 200 μg/mL), masukkan ke dalam labu tentukur 20 mL, encerkan dengan metanol sampai tanda. Pipet 1 mL larutan, masukkan ke dalam labu tentukur 20 mL, encerkan dengan metanol sampai tanda. Catatan: Untuk menjaga stabilitas, larutan disimpan pada suhu -18°C dan terlindung dari cahaya.
c.Larutan Baku Seri (kurva baku) 1) Larutan Baku 5 ppb Pipet 50 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 2) Larutan Baku 10 ppb Pipet 100 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 3) Larutan Baku 20 ppb Pipet 200 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 4) Larutan Baku 40 ppb Pipet 400 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 5) Larutan Baku 60 ppb Pipet 600 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 6) Larutan Baku 80 ppb Pipet 800 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 7) Larutan Baku 100 ppb Pipet 1000 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda.
d.Larutan Uji Timbang saksama lebih kurang 500 mg bahan baku Metformin hidroklorida, masukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, tambahkan 5 mL Pelarut. Sonikasi selama 5 menit, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. Saring larutan menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,2 μm.
e.Cara Penetapan Suntikkan masing-masing Pelarut, Larutan Baku Seri dan Larutan Uji ke dalam Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi – Spektrometri Massa dengan kondisi sebagai berikut: Fasa Gerak : Larutan A: Larutan Asam Format 0,2%. Larutan B: Asetonitril Sistem Elusi Gradien digunakan sebagai berikut: Waktu (menit) Laju Alir (mL/min) Larutan A (%) Larutan B (%) 0,0 0,25 99 1 5,0 0,25 95 5 7,0 0,25 90 10 9,0 0,25 5 95 9,5 0,4 0 100 10,5 0,4 0 100 10,6 0,25 99 1 12,0 0,25 99 1 Kolom : Kolom C18 dengan panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm dengan ukuran partikel 1,8 μm. Suhu Kolom : 30°C Volume penyuntikan : 10 μL Suhu Injektor : 5°C Detektor : MS/MS Tipe reaksi : MRM Parameter Detektor MS/MS: Sumber Ion : APCI (positif) APCI+ Source Corona (kV) : 2,0 Cone (V) : 40 Extractor (V) : 2 RF Lens (V) : 2,6 Source Temp : 135°C APcI Temp : 450°C Gas Flow (L/hr) : Desolvation: 900; Cone: 20 Analyser LM Resolution 1 : 6,5 HM Resolution 1 : 13,0 Ion Energy 1 : -1,8 Collision : 10 Entrance : 1 Exit : 1 LM Resolution 2 : 5,5 HM Resolution 2 : 12,0 Ion Energy 2 : 0,4 Gain : 1,00 Collision Gas Flow : 0,25 mL/menit MRM Parameter Polarity : Ion Positif Tipe Scan : MRM Waktu Scan : 0-12 menit Scan Menit Keterangan 0,0 1,8 Waste 1,8 4,0 LC 4,0 12,0 Waste Nama Analit Parent (m/z) Daughter (m/z) Dwell (s) Cone (V) Collision (V) NDMA 74,83 42,8 0,1 40 11 NDMA 74,83 57,8 0,1 40 8 *ion kuantitasi
f.Interpretasi Hasil Jumlah NDMA (ng/mg) dalam bahan baku dihitung menggunakan rumus (x): K = [(y-a) / b] x Fu ÷ wt Keterangan: y = Luas puncak NDMA Larutan Uji a = Nilai intersep yang dihasilkan dari kurva baku b = Nilai slope yang dihasilkan dari kurva baku Fu = Faktor pengenceran Larutan Uji Wt = Bobot uji serbuk bahan baku Metformin hidroklorida dalam mg. C. Penetapan Kadar Cemaran N-Nitrosodimetilamin (NDMA) dalam Tablet Metformin Hidroklorida Secara Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi- Spektrometri Massa (LC-MS/MS) Ruang Lingkup Metode ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran N- Nitrosodimetilamin (NDMA) dalam tablet Metformin hidroklorida secara Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi - Spektrometri Massa (LC-MS/MS). Baku Pembanding N-Nitrosodimethylamine (NDMA) konsentrasi 200 μg/mL. Peralatan Seperangkat alat Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi dengan kolom C18, panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm, dan ukuran partikel 1,8 μm dilengkapi detektor MS/MS. * Pada penelitian ini digunakan kolom HSS-T3 (Waters), dapat digunakan tipe kolom lain yang setara. Prosedur
a.Pelarut Air bebas mineral.
b.Larutan Baku Persediaan NDMA (500 ppb) Pipet 1 mL baku NDMA (konsentrasi 200 μg/mL), masukkan ke dalam labu tentukur 20 mL, encerkan dengan metanol sampai tanda. Pipet 1 mL larutan, masukkan ke dalam labu tentukur 20 mL encerkan dengan metanol sampai tanda. Catatan: Untuk menjaga stabilitas, larutan disimpan pada suhu -18°C dan terlindung dari cahaya.
c.Larutan Baku Seri (kurva baku) 1) Larutan Baku 5 ppb Pipet 50 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 2) Larutan Baku 10 ppb Pipet 100 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 3) Larutan Baku 20 ppb Pipet 200 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 4) Larutan Baku 40 ppb Pipet 400 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 5) Larutan Baku 60 ppb Pipet 600 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 6) Larutan Baku 80 ppb Pipet 800 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda. 7) Larutan Baku 100 ppb Pipet 1000 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut sampai tanda.
d.Larutan Uji Timbang tidak kurang dari 20 tablet dan tentukan bobot rata-ratanya serbukkan dan homogenkan. Timbang saksama serbuk setara dengan 500 mg Metformin hidroklorida, masukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, tambahkan 2 mL Pelarut, kocok larutan menggunakan vortex selama 1 menit. Encerkan larutan dengan Pelarut sampai tanda. Sentrifugasi larutan selama 5 menit dengan kecepatan 14000 rpm pada suhu 5°C. Saring larutan menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,2 μm.
e.Cara Penetapan Suntikkan masing-masing Pelarut, Larutan Baku Seri dan Larutan Uji ke dalam Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi Spektrofotometri Massa dengan kondisi sebagai berikut: Fasa Gerak : Larutan A: Larutan Asam Format 0,2%. Larutan B: Asetonitril Sistem Elusi Gradien yang digunakan sebagai berikut: Waktu (menit) Laju Alir (mL/min) Larutan A (%) Larutan B (%) 0,0 0,25 99 1 5,0 0,25 95 5 7,0 0,25 90 10 9,0 0,25 5 95 9,5 0,4 0 100 10,5 0,4 0 100 10,6 0,25 99 1 12,0 0,25 99 1 Kolom : Kolom C18 dengan panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm dengan ukuran partikel 1,8 μm. Suhu Kolom : 30°C Volume penyuntikan : 10 μL Suhu Injektor : 5°C Detektor : MS/MS Tipe reaksi : MRM Parameter Detektor MS/MS: Sumber Ion : APCI (positif) APCI+ Source Corona (kV) : 2,0 Cone (V) : 40 Extractor (V) : 2 RF Lens (V) : 2,6 Source Temp : 135°C APcI Temp : 450°C Gas Flow (L/hr) : Desolvation: 900; Cone: 20 Parameter Detektor MS/MS (lanjutan): Analyser LM Resolution 1 : 6,5 HM Resolution 1 : 13,0 Ion Energy 1 : -1,8 Collision : 10 Entrance : 1 Exit : 1 LM Resolution 2 : 5,5 HM Resolution 2 : 12,0 Ion Energy 2 : 0,4 Gain : 1,00 Collision Gas Flow : 0,25 mL/menit MRM Parameter Polarity : Ion Positif Tipe Scan : MRM Waktu Scan : 0-12 menit Scan Menit Keterangan 0,0 1,8 Waste 1,8 4,0 LC 4,0 12,0 Waste Nama Analit Parent (m/z) Daughter (m/z) Dwell (s) Cone (V) Collision (V) NDMA 74,83 42,8 0,1 40 11 NDMA 74,83 57,8 0,1 40 8 *ion kuantitasi
f.Interpretasi Hasil Jumlah NDMA (ng/mg) (K) dalam tablet Metformin hidroklorida (ppm): K = [(y-a) / b] x Fu÷ wt Keterangan: y = Luas puncak NDMA Larutan Uji a = Nilai intersep yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku b = Nilai slope yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku Fu = Faktor pengenceran Larutan Uji Wt = Bobot uji serbuk tablet Metformin hidroklorida dalam mg. D. Penetapan Kadar Cemaran N-Nitrosodimetilamin (NDMA) dalam Tablet Lepas Lambat Metformin Hidroklorida Secara Headspace Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (HS-KGMS) Ruang Lingkup Metode ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran N- Nitrosodimetilamin (NDMA) dalam tablet lepas lambat metformin hidroklorida secara Headspace Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (HS- KGMS). Baku Pembanding N-Nitrosodimethylamine (NDMA) konsentrasi 200 μg/mL. Peralatan Seperangkat alat Kromatograf Gas-Spektrometri Massa (KG-MS) dengan kolom G43 dengan panjang 30 m, diameter dalam 0,25 mm, dan ketebalan film 1,4 μm, dilengkapi autosampler Headspace. * Pada penelitian ini digunakan kolom VF-624ms (Agilent), dapat digunakan tipe kolom lain yang setara. Prosedur
a.Pelarut Dimetilsulfoksida.
b.Larutan Baku Persediaan NDMA (500 ppb) Pipet 1 mL baku NDMA 200 μg/mL, masukkan ke dalam labu tentukur 20 mL. Encerkan dengan metanol sampai tanda dan kocok. Pipet 1 mL larutan, masukkan ke dalam labu tentukur 20 mL. Encerkan dengan Pelarut sampai tanda dan kocok. Catatan: Untuk menjaga stabilitas, larutan disimpan pada suhu -18°C dan terlindung dari cahaya.
c.Larutan Baku Seri (kurva baku) 1) Larutan Baku 5 ppb Pipet 50 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL. Encerkan dengan Pelarut sampai tanda dan kocok homogen. 2) Larutan Baku 10 ppb Pipet 100 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL. Encerkan dengan Pelarut sampai tanda dan kocok homogen. 3) Larutan Baku 20 ppb Pipet 200 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL. Encerkan dengan Pelarut sampai tanda dan kocok homogen. 4) Larutan Baku 40 ppb Pipet 400 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL. Encerkan dengan Pelarut sampai tanda dan kocok homogen. 5) Larutan Baku 60 ppb Pipet 600 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL. Encerkan dengan Pelarut sampai tanda dan kocok homogen. 6) Larutan Baku 80 ppb Pipet 800 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL. Encerkan dengan Pelarut sampai tanda dan kocok homogen. 7) Larutan Baku 100 ppb Pipet 1000 μL Larutan Baku Persediaan NDMA, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL. Encerkan dengan Pelarut sampai tanda dan kocok homogen.
d.Larutan Uji Timbang saksama tidak kurang dari 20 tablet. Tentukan bobot rata- rata tablet, serbukkan hingga homogen. Timbang saksama sejumlah serbuk setara dengan 500 mg metformin hidroklorida, masukkan ke dalam vial headspace 20 mL. Pipet 5 mL dimetilsulfoksida, masukkan ke dalam vial headspace, kocok menggunakan vortex selama 2 menit.
e.Cara Penetapan Suntikkan Pelarut, Larutan Baku Seri dan Larutan Uji masing- masing ke dalam Headspace Kromatografi Gas-Spektrometri Massa dengan kondisi sebagai berikut: Parameter Kromatografi Gas Kolom : Kolom G43 dengan panjang 30,0 m, dimeter dalam 0,25 mm dan ukuran partikel 1,4 μm Column Oven Temperature : 60°C Injection Temperature : 240°C Program : Column Oven Temperature (15 menit) Rate Final Temperature Hold Time - 60,0 2,00 15,00 240,0 0,00 Injection Mode : Split Carrier Gas : Helium Flow Control Mode : Linear Velocity Total Flow : 9,0 mL/menit Column Flow : 1,00 mL/menit Linear Velocity : 36,5 cm/detik Purge Flow : 3,0 mL/menit Split Ratio : 5,0 Parameter Spektrometri Massa Ion Source Temperature : 230°C Interface Temperature : 250°C Metode deteksi : SIM (Single Ion Monitoring) Solvent Cut Time : 3 menit Start Time (meni t) End Time (meni t) Acq. Mode Event Time (detik) Ch1 (m/z) 3,50 6,50 SIM 0,30 74,00 Detector Voltage : Relative to the Tuning Result Metode deteksi : SIM (Single Ion Monitoring) Sumber ion : EI (Electron Impact) Identifikasi : Berdasarkan waktu retensi Parameter Headspace Autosampler Incubation Temperature : 120°C Incubation Time : 15 menit Syringe Temperature : 130°C Agitator Speed : 250 rpm GC Runtime : 20 menit Volume Injeksi : 1000 μL
f.Interpretasi Hasil Jumlah NDMA (ng/mg) (K) dalam tablet lepas lambat Metformin hidroklorida (ppm): K = [(y-a) / b] x Fu ÷ wt Keterangan: y = Luas puncak NDMA Larutan Uji a = Nilai intersep yang dihasilkan dari kurva baku b = Nilai slope yang dihasilkan dari kurva baku Fu = Faktor pengenceran Larutan Uji Wt = Bobot uji serbuk tablet lepas lambat Metformin hidroklorida dalam mg. E. Penetapan Kadar Cemaran N-Nitrosodimetilamin (N-NDMA) dalam Injeksi Ranitidin Hidroklorida Secara Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi-Spektrometri Massa (KCKT-MS/MS) Ruang Lingkup Metode ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran N- Nitrosodimetilamin (N-NDMA) dalam injeksi Ranitidin hidroklorida secara Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi-Spektrometri Massa (KCKT- MS/MS). Baku Pembanding N-Nitrosodimethylamine konsentrasi 200 μg/mL dalam metanol. Peralatan Seperangkat alat Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi dengan kolom berisi gugus oktadesilsilana (C18), panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm, dan ukuran partikel 1,8 μm dilengkapi detektor Triple Quadropole MS/MS. * Pada penelitian ini digunakan kolom HSS-T3 (Waters), dapat digunakan tipe kolom lain yang setara. Prosedur
a.Pelarut Asam format 0,1%.
b.Larutan Baku Persediaan Masukkan 1 mL baku N-NDMA (konsentrasi 200 μg/mL) ke dalam labu tentukur 20 mL, dan encerkan dengan metanol sampai tanda. Pipet 500 μL larutan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL dan diencerkan dengan pelarut sampai tanda (konsentrasi N-NDMA 500 ppb). Catatan: Untuk menjaga stabilitas, larutan disimpan pada suhu -18°C dan terlindung dari cahaya
c.Larutan Baku Seri (kurva baku) 1) Larutan Baku 3 ppb Pipet 30 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda. 2) Larutan Baku 5 ppb Pipet 50 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda. 3) Larutan Baku 10 ppb Pipet 100 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda.
d.Larutan Uji Ambil 5 vial injeksi, keluarkan isinya, masukkan ke dalam erlenmeyer 10 mL dan homogenkan. Pipet 1 mL injeksi setara dengan 25 mg Ranitidin hidroklorida, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, dan encerkan dengan pelarut hingga tanda. Saring larutan menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,2 μm.
e.Cara Penetapan Suntikan masing-masing Pelarut, Larutan Baku Seri, dan Larutan Uji ke dalam Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi-Spektrometri Massa dengan kondisi sebagai berikut: Fase Gerak : Larutan A: Larutan asam format 0,1%. Larutan B: Metanol derajat MS Sistem Gradien yang digunakan adalah sebagai berikut: Waktu (menit) Laju Alir (mL/min) Larutan A (%) Larutan B (%) 0,0 0,25 99 1 5,0 0,25 95 5 7,0 0,25 90 10 9,0 0,25 5 95 9,5 0,4 0 100 10,5 0,4 0 100 10,6 0,25 99 1 12,0 0,25 99 1 Kolom : Kolom C18 dengan panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm dengan ukuran partikel 1,8 μm Suhu Kolom : 40 °C Volume penyuntikan : 10 μL Suhu Injektor : 5°C Parameter Detektor MS/MS: Sumber Ion : APCI + Source : APCI (positif) Corona (kV) : 2,8 Cone (V) : 32 Extractor (V) : 3 RF Lens (V) : 1,6 Source Temp : 100°C APcI Temp : 250°C Gas Flow (L/hr) : Desolvation: 400; Cone: 0 Parameter Detektor MS/MS (lanjutan): Analyser LM Resolution 1 : 11,5 HM Resolution 1 : 11,5 Ion Energy 1 : -0,1 Collision : 10 Entrance : -2 Exit : 1 LM Resolution 2 : 10,0 HM Resolution 2 : 10,0 Ion Energy 2 : 0,7 Gain : 1,00 Collision Gas Flow : 0,25 mL/menit MRM Parameter Polarity : Ion Positif Tipe scan : MRM Waktu scan : 0-12,10 menit Method Events Time (Minute) Event Action 0,00 Stop Flow 0 1,50 Flow State LC 4,00 Flow State Waste 9,50 Flow State LC 12,00 Flow State Waste MS Method
1.MRM of 3 Mass pairs, Time 1,80 to 3,80 API+ (n-NDMA)
2.MRM of 2 Mass pairs, Time 4,03 to 12,00 API+ (Ranitidine) Nama Analit Parent (m/z) Daughter (m/z) Dwell (s) Cone (V) Collision (V) N-NDMA 75 42,95* 0,1 30 11 N-NDMA 75 43,95 0,1 30 11 N-NDMA 75 58 0,1 30 10 *ion kuantitasi Nama Analit Parent (m/z) Daughter (m/z) Dwell (s) Cone (V) Collision (V) Ranitidin 314,85 175,7 0,1 30 15 Ranitidin 314,85 269,8 0,1 30 10
f.Interpretasi Hasil Jumlah N-NDMA (ng/mL) dihitung menggunakan rumus: Kadar = (𝑦−𝑏) 𝑎 𝑥 𝐹𝑝 𝑉 Keterangan: y = luas puncak N-NDMA yang diperoleh dari alat b = nilai intersep yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku a = nilai slope yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku Fp = faktor pengenceran V = Volume contoh uji (mL) F. Penetapan Kadar Cemaran N-Nitrosodimetilamin (N-NDMA) dalam Bahan Baku Ranitidin Hidroklorida secara Kroamatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi- Spektrometri Massa (LC-MS/MS) Ruang Lingkup Metode ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran N- Nitrosodimetilamin (N-NDMA) dalam bahan baku ranitidin hidroklorida secara Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi-Spektrometri Massa (LC- MS/MS). Baku Pembanding N-Nitrosodimethylamine solution certified reference material (Sigma Aldrich): konsentrasi 200 μg/mL dalam metanol. Peralatan Seperangkat alat Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi dengan kolom berisi gugus oktadesilsilana (C18), panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm, dan ukuran partikel 1,8 μm dilengkapi detektor Triple Quadropole MS/MS. * Pada penelitian ini digunakan kolom HSS-T3 (Waters), dapat digunakan tipe kolom lain yang setara. Prosedur
a.Pelarut Asam format 0,1%.
b.Larutan Baku Persediaan Masukkan 1 mL baku N-NDMA (konsentrasi 200 μg/mL) ke dalam labu tentukur 20 mL, dan encerkan dengan metanol sampai tanda. Pipet 500 μL larutan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL dan diencerkan dengan Pelarut sampai tanda (konsentrasi N-NDMA 500 ppb). Catatan: Untuk menjaga stabilitas, larutan disimpan pada suhu -18°C dan terlindung dari cahaya.
c.Larutan Baku Seri (kurva baku) 1) Larutan Baku 3 ppb Pipet 30 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda. 2) Larutan Baku 5 ppb Pipet 50 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda. 3) Larutan Baku 10 ppb Pipet 100 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda. 4) Larutan Baku 20 ppb Pipet 200 μL Larutan Baku Persediaan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, diencerkan dengan Pelarut hingga tanda. 5) Larutan Baku 50 ppb Pipet 50 μL Larutan Baku Persediaan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, diencerkan dengan Pelarut hingga tanda. 6) Larutan Baku 80 ppb Pipet 800 μL Larutan Baku Persediaan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, diencerkan dengan Pelarut hingga tanda.
d.Larutan Uji Timbang saksama sejumlah 750 mg bahan baku ranitidin hidroklorida, masukkan ke dalam erlenmeyer labu tentukur 25 mL, tambahkan 15 mL Pelarut, kocok menggunakan vortex selama 2 menit, encerkan dengan Pelarut hingga tanda, diamkan 5 menit. Saring larutan menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,2 μm.
e.Cara Penetapan Suntikan masing-masing Pelarut, Larutan Baku Seri, dan Larutan Uji ke dalam Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi-Spektrometri Massa dengan kondisi sebagai berikut: Fase Gerak : Larutan A: Larutan asam format 0,1%. Larutan B: Metanol derajat MS Sistem Gradien yang digunakan adalah sebagai berikut: Waktu (menit) Laju Alir (mL/min) Larutan A (%) Larutan B (%) 0,0 0,25 99 1 5,0 0,25 95 5 7,0 0,25 90 10 9,0 0,25 5 95 9,5 0,4 0 100 10,5 0,4 0 100 10,6 0,25 99 1 12,0 0,25 99 1 Kolom : Kolom C18 dengan panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm dengan ukuran partikel 1,8 μm, berisi gugus oktadesilsilana (C18) Suhu Kolom : 40 °C Volume penyuntikan : 10 μL Suhu Injektor : 5°C Detektor : Triple Quadropole MS/MS Tipe reaksi : MRM Parameter Detektor MS/MS: Sumber Ion APCI + Source : APCI (positif) Corona (kV) : 2,8 Cone (V) : 32 Extractor (V) : 3 RF Lens (V) : 1,6 Source Temp : 100°C APcI Temp : 250°C Gas Flow (L/hr) : Desolvation: 400; Cone: 0 Parameter Detektor MS/MS (lanjutan): Analyser LM Resolution 1 : 11,5 HM Resolution 1 : 11,5 Ion Energy 1 : -0,1 Collision : 10 Entrance : -2 Exit : 1 LM Resolution 2 : 10,0 HM Resolution 2 : 10,0 Ion Energy 2 : 0,7 Gain : 1,00 Collision Gas Flow : 0,25 mL/menit MRM Parameter Polarity : Ion Positif Tipe scan MRM Waktu scan 0-12,10 menit Method Events Time (Minute) Event Action 0,00 Stop Flow 0 1,50 Flow State LC 4,00 Flow State Waste 9,50 Flow State LC 12,00 Flow State Waste MS Method
1.MRM of 3 Mass pairs, Time 1,80 to 3,80 API+ (n-NDMA)
2.MRM of 2 Mass pairs, Time 4,03 to 12,00 API+ (Ranitidine) Nama Analit Parent (m/z) Daughter (m/z) Dwell (s) Cone (V) Collision (V) N-NDMA 75 42,95* 0,1 30 11 N-NDMA 75 43,95 0,1 30 11 N-NDMA 75 58 0,1 30 10 *ion kuantitasi Nama Analit Parent (m/z) Daughter (m/z) Dwell (s) Cone (V) Collision (V) Ranitidin 314,85 175,7 0,1 30 15 Ranitidin 314,85 269,8 0,1 30 10
f.Interpretasi Hasil Hitung Jumlah N-NDMA tiap mg Bahan Baku (ng/mg) menggunakan rumus: x = ((y-b))/a x Fp/Bu Keterangan: y : luas puncak N-NDMA yang diperoleh dari alat b : nilai intersep yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku a : nilai slope yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku Fp : pengenceran (mL) Bu : bobot uji (mg) G. Penetapan Kadar Cemaran N-Nitrosodimetilamin (N-NDMA) dalam Tablet Ranitidin Hidroklorida secara Kroamatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi- Spektrometri Massa (KCKT-MS/MS) Ruang Lingkup Metode ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran N- Nitrosodimetilamin (N-NDMA) dalam tablet ranitidin hidroklorida secara Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi-Spektrometri Massa (LC-MS/MS). Baku Pembanding N-Nitrosodimethylamine solution certified reference material (Sigma Aldrich): konsentrasi 200 μg/mL dalam metanol. Peralatan Seperangkat alat Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi dengan kolom berisi gugus oktadesilsilana (C18), panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm, dan ukuran partikel 1,8 μm dilengkapi detektor Triple Quadropole MS/MS. * Pada penelitian ini digunakan kolom HSS-T3 (Waters), dapat digunakan tipe kolom lain yang setara. Prosedur
a.Pelarut Asam format 0,1%.
b.Larutan Baku Persediaan Masukkan 1 mL baku N-NDMA (konsentrasi 200 μg/mL) ke dalam labu tentukur 20 mL, dan encerkan dengan metanol sampai tanda. Pipet 500 μL larutan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL dan diencerkan dengan pelarut sampai tanda (konsentrasi N-NDMA 500 ppb). Catatan: Untuk menjaga stabilitas, larutan disimpan pada suhu - 18°C dan terlindung dari cahaya.
c.Larutan Baku Seri (kurva baku) 1) Larutan Baku 3 ppb Pipet 30 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda. 2) Larutan Baku 5 ppb Pipet 50 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda. 3) Larutan Baku 10 ppb Pipet 100 μL Larutan Baku Persediaan, masukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, encerkan dengan Pelarut hingga tanda. 4) Larutan Baku 20 ppb Pipet 200 μL Larutan Baku Persediaan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, diencerkan dengan Pelarut hingga tanda. 5) Larutan Baku 50 ppb Pipet 50 μL Larutan Baku Persediaan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, diencerkan dengan Pelarut hingga tanda. 6) Larutan Baku 80 ppb Pipet 800 μL Larutan Baku Persediaan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 5 mL, diencerkan dengan Pelarut hingga tanda.
d.Larutan Uji Timbang tidak kurang dari 10 tablet dan tentukan bobot rata-ratanya lalu diserbukan dan homogenkan. Timbang saksama serbuk setara dengan 150 mg Ranitidin hidroklorida, masukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, tambahkan 2 mL pelarut, kocok larutan menggunakan vortex selama 1 menit dan tambahkan pelarut sampai tanda. Sentrifugasi larutan selama 5 menit dengan kecepatan 14000 rpm pada suhu 5°C. Saring larutan menggunakan penyaring membran dengan porositas 0,2 μm.
e.Cara Penetapan Suntikan masing-masing Pelarut, Larutan Baku Seri, dan Larutan Uji ke dalam Kromatograf Cair Kinerja Ultra Tinggi-Spektrometri Massa dengan kondisi sebagai berikut: Fase Gerak : Larutan A: Larutan asam format 0,1%. Larutan B: Metanol derajat MS Sistem Gradien yang digunakan adalah sebagai berikut: Waktu (menit) Laju Alir (mL/min) Larutan A (%) Larutan B (%) 0,0 0,25 99 1 5,0 0,25 95 5 7,0 0,25 90 10 9,0 0,25 5 95 9,5 0,4 0 100 10,5 0,4 0 100 10,6 0,25 99 1 12,0 0,25 99 1 Kolom : Kolom C18 dengan panjang 100 mm, diameter dalam 2,1 mm dengan ukuran partikel 1,8 μm Suhu Kolom : 40 °C Volume penyuntikan : 10 μL Suhu Injektor : 5°C Detektor : Triple Quadropole MS/MS Tipe reaksi : MRM Parameter Detektor MS/MS: Sumber Ion APCI + Source : APCI (positif) Corona (kV) : 2,8 Cone (V) : 32 Extractor (V) : 3 RF Lens (V) : 1,6 Source Temp : 100°C APcI Temp : 250°C Gas Flow (L/hr) : Desolvation: 400; Cone: 0 Parameter Detektor MS/MS (lanjutan): Analyser LM Resolution 1 : 11,5 HM Resolution 1 : 11,5 Ion Energy 1 : -0,1 Collision : 10 Entrance : -2 Exit : 1 LM Resolution 2 : 10,0 HM Resolution 2 : 10,0 Ion Energy 2 : 0,7 Gain : 1,00 Collision Gas Flow : 0,25 mL/menit MRM Parameter Polarity : Ion Positif Tipe scan MRM Waktu scan 0-12,10 menit Method Events Time (Minute) Event Action 0,00 Stop Flow 0 1,50 Flow State LC 4,00 Flow State Waste 9,50 Flow State LC 12,00 Flow State Waste MS Method
3.MRM of 3 Mass pairs, Time 1,80 to 3,80 API+ (n-NDMA)
4.MRM of 2 Mass pairs, Time 4,03 to 12,00 API+ (Ranitidine) Nama Analit Parent (m/z) Daughter (m/z) Dwell (s) Cone (V) Collision (V) N-NDMA 75 42,95* 0,1 30 11 N-NDMA 75 43,95 0,1 30 11 N-NDMA 75 58 0,1 30 10 *ion kuantitasi Nama Analit Parent (m/z) Daughter (m/z) Dwell (s) Cone (V) Collision (V) Ranitidin 314,85 175,7 0,1 30 15 Ranitidin 314,85 269,8 0,1 30 10
f.Interpretasi Hasil Jumlah NDMA dihitung menggunakan rumus (x): x = (𝑦−𝑏) 𝑎 𝑥 𝐹𝑝 𝑥 𝐵𝑟 𝐵𝑢 Keterangan: y : luas puncak N-NDMA yang diperoleh dari alat b : nilai intersep yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku a : nilai slope yang dihasilkan dari kurva kalibrasi baku Fp : faktor pengenceran V : bobot uji (mg) GLOSARIUM Acceptable Intake (AI) adalah ambang batas asupan dengan risiko terhadap kesehatan dapat diabaikan. Threshold of Toxicological Concern (TTC) adalah pendekatan yang dikembangkan untuk menentukan asupan yang dapat diterima dari suatu senyawa kimia yang belum dipelajari dengan risiko efek karsinogenik atau efek toksik lain dapat diabaikan. FORMULIR Formulir 1A. Penilaian Risiko Keberadaan Cemaran Nitrosamin untuk Industri Bahan Obat dan Bahan Antara untuk Bahan Obat Penilaian risiko keberadaan Cemaran Nitrosamin harus dilakukan oleh Industri Farmasi untuk masing-masing dan setiap bahan baku Obat dan bahan antara untuk bahan baku, dilengkapi dengan dokumen pendukung dari produsen bahan baku Obat. Beberapa hal dibawah ini harus dipertimbangkan pada proses pembuatan Bahan Obat sebagaimana Cemaran Nitrosamin berpotensi terbentuk. Nama Produk : Nama Industri Bahan Obat : Bahan Obat yang Diproduksi : Alamat Industri Bahan Obat : Jenis Industri Bahan Obat : ◻ Bahan baku Obat ◻ Bahan antara untuk bahan baku Jenis Registrasi Bahan Obat ke Regulator ◻ Nomor CEP (jika ada): ◻ Nomor DMF: No. Pertanyaan Ya Tidak 1 Apakah dalam sintesis Bahan Obat digunakan anorganik nitrit (termasuk dalam pembuatan bahan awal/antara)? ◻ ◻ 2 Apakah sumber nitrit berpotensi terkandung dalam proses sintesis Bahan Obat (termasuk dalam pembuatan bahan awal/antara), atau mungkinkah cemaran nitrit atau sumber nitrit terdapat pada bahan awal, pereaksi, katalis/bahan pembantu atau pelarut?* *contoh: nitrat + bahan pereduksi; HNO3 + logam pereduksi; urea/ammonium + hipoklorit/klorin ◻ ◻ 3 Apakah pada proses sintesis Bahan Obat digunakan pelarut daur ulang dan/atau bahan-bahan dari proses sintesis yang berbeda (termasuk dalam pembuatan bahan awal/antara)? ◻ ◻ 4 Apakah bagian peralatan yang tidak khusus (misal tanki penyimpanan) digunakan untuk Bahan Obat/senyawa sejenis lain yang berisiko terpapar nitrit? ◻ ◻ Jika terdapat jawaban “Ya” untuk pertanyaan nomor 1-4, lanjutkan ke pertanyaan nomor 5 6, dan 7. Jika jawaban “Tidak” untuk seluruh pertanyaan nomor 1-4, lanjutkan ke pertanyaan nomor 7 5 Apakah pada proses sintesis Bahan Obat digunakan amin sekunder atau tersier (contoh trietilamin, diisopropilamin (Hunig’s base=N, N- Diisopropiletilamin), N-metilmorfolin (NMM), tributilamin (TBA)) (termasuk dalam pembuatan prekursor/bahan antara)? ◻ ◻ 6 Apakah pada proses sintesis Obat terdapat sumber amin (termasuk dalam pembuatan bahan awal/antara), atau mungkinkah amin atau sumber amin terdapat sebagai cemaran pada bahan awal, pereaksi, katalis/bahan pembantu atau pelarut (contoh dimetilformamida)? ◻ ◻ 7 Mungkinkah Nitrosamin terkandung sebagai cemaran pada bahan awal, pereaksi, katalis, bahan pembantu atau pelarut? ◻ ◻ Kesimpulan kajian risiko untuk industri Jika jawaban “Ya” untuk pertanyaan nomor 5, 6, atau 7, proses pembuatan bahan baku Obat/bahan antara dianggap Berisiko Tercemar Nitrosamin. Lanjutkan dengan penilaian risiko untuk masing-masing bahan baku Obat dan bahan antara untuk bahan baku, kemudian lanjutkan kajian keberadaan Cemaran Nitrosamin untuk Obat yang mengandung bahan baku Obat sesuai Formulir 1B. Formulir 1B. Penilaian Risiko Keberadaan Cemaran Nitrosamin untuk Industri Obat (Produk Jadi dan Produk Ruahan) Penilaian risiko keberadaan Cemaran Nitrosamin harus dilakukan oleh Industri Farmasi untuk masing-masing dan meliputi seluruh produk jadi dan produk ruahan termasuk yang dipindahtangankan. Beberapa hal dibawah ini harus dipertimbangkan pada proses pembuatan Obat sebagaimana Cemaran Nitrosamin berpotensi terbentuk. Nama Obat : Nama Produsen Obat : Alamat Produsen Obat : Nama Pemilik Izin Obat : Alamat Pemilik Izin Obat : Jenis Industri Obat : ◻ Produk Jadi ◻ Produk Ruahan Jenis Registrasi Obat : ◻ Nomor Izin Edar: ◻ Nomor Aju Registrasi: No. Pertanyaan Ya Tidak 1 Apakah terdapat potensi sumber nitrit atau mungkinkah cemaran nitrit atau sumber nitrit terdapat pada eksipien atau pelarut?* *contoh: nitrat + bahan pereduksi’ HNO3 + logam pereduksi; urea/ammonium + hipoklorit/klorin ◻ ◻ 2 Apakah mungkin Nitrosamin terkandung sebagai cemaran pada eksipien atau pelarut? ◻ ◻
3.Apakah peralatan yang digunakan untuk produksi digunakan bersama dengan produk lain yang beresiko terpapar nitrit? Jika jawaban “Ya” untuk pertanyaan nomor 3, lanjutkan ke pertanyaan nomor 4 4 Apakah pada saat pelaksanaan validasi pembersihan belum dilakukan uji residu Nitrosamin? Kesimpulan kajian risiko untuk industri Jika jawaban “Ya” untuk pertanyaan nomor 1, 2, 3, atau 4 proses pembuatan produk jadi/produk ruahan dianggap Berisiko Tercemar Nitrosamin. Lanjutkan dengan penilaian risiko untuk masing-masing dan setiap produk jadi dan produk ruahan. Formulir 1C. Ringkasan Hasil Penilaian Risiko Keberadaan Cemaran Senyawa Nitrosamin dan Turunannya pada Bahan Obat Nama Bahan aktif Obat : Nama Industri bahan Obat : Alamat Industri Bahan Obat : Bahan yang Digunakan dalam Sintesis Bahan Obat No. Nama Produsen Alamat Produsen Bahan Baku Obat yang Diproduksi Risiko Kontaminasi Senyawa Nitrosamin dan Turunannya Ya Tidak 1 ◻ ◻ 2 ◻ ◻ 3 ◻ ◻ 4 ◻ ◻ 5 ◻ ◻ … ◻ ◻ Formulir 1D. Ringkasan Hasil Penilaian Risiko Keberadaan Cemaran Senyawa Nitrosamin dan Turunannya pada Obat Nama Produsen Obat : Alamat Produsen Obat : Nama Pemilik Izin Obat : Alamat Pemilik Izin Obat : Informasi Bahan Obat yang Digunakan di Industri Obat No. Nama Bahan Obat Alamat Produsen Bahan Obat Risiko Kontaminasi Senyawa Nitrosamin dan Turunannya Ya Tidak 1 2 3 4 5 … Informasi Obat No. Nama Obat dan Bentuk Sediaan nomor Izin Edar Risiko Kontaminasi Senyawa Nitrosamin dan Turunannya Ya Tidak 1 2 3 4 5 … KEPALA BADAN PENGAWAS OBAT DAN MAKANAN, ttd. PENNY K. LUKITO